Nutrients用户文章 | 通过多组学联合探究黄酮对昼夜节律紊乱小鼠肠道菌群和下丘脑节律基因的调节作用|单细胞专题

论文标题：The Modulatory Effect of Cyclocarya paliurus Flavonoids on Intestinal Microbiota and Hypothalamus Clock Genes in a Circadian Rhythm Disorder Mouse Model

刊登日期：2022年05月31日

发表杂志：Nutrients

影响因子：6.706

研究机构：宁波大学食品与药学学院食品科学与工程系

技术手段：非靶向代谢组学、单细胞转录组测序、联川生物Omicstudio云平台

文章架构

主要研究内容

一、施用CPF可改善昼夜节律紊乱小鼠肠道菌群的紊乱

作者发现CD组中的OTU和CHAO1显着低于其他组，Shannon和Simpson指数都表明，CPF组的粪便微生物多样性显着高于CD组（图1A，表1）。并且微生物群落主要是拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、疣微菌门（Verrucomicrobia）、放线菌门（Actinobacteria）和软壁菌门（Tenericutes）（图1B）。昼夜节律紊乱4周后，与CT组相比，CD组小鼠的拟杆菌门的相对丰度呈明显下降趋势，厚壁菌门的相对丰度则上升，而经CPF处理后拟杆菌的丰度增加并且厚壁菌门的丰度降低（图1C）。

随后作者又在属水平上进行分析，发现施用CPF后，昼夜节律紊乱降低了Muribaculaceae的丰度，并显着增加了Parabacteroides、Clostridiales、Ruminiclostridium和Lachnospiraceae的丰度（图1D，图1E）。在连续施用4周CPF后，梭状芽胞杆菌（Clostridiales）和瘤胃梭菌（Ruminiclostridium）的相对丰度下降，与CT组一致（图1F），其中阿克曼菌属（Akkermansia）的相对丰度增加，显示出与其他组不同的显着特征（图1G）。随后作者深入分析了昼夜节律紊乱过程中拟杆菌门和厚壁菌门丰度的变化。发现随着昼夜节律紊乱4周后，厚壁菌门的丰度增加，而拟杆菌门则相反（图1H），而Akkermansia的相对丰度仅在CPF组中增加（图1I）。结果表明CPF可能具有增加大量重要微生物群并改善昼夜节律紊乱引起的肠道微生物群失调的潜力。

二、代谢差异表征

作者通过非靶向代谢组学对不同组别进行分析。通过PCA分析发现CD组和CPF组之间有显著差异，施用CPF影响了昼夜节律紊乱小鼠的代谢（图2A，图2B）。同时PLS-DA分析表示模型没有出现过拟合（图2C）。

三、CPF对昼夜节律紊乱小鼠肠道代谢产物的影响

作者通过代谢组学分析发现数千种差异肠道代谢物，并用火山图表示（图2D，图2E）。通过最CD组和CT组中差异代谢物的分析，发现其中42.86%的化合物为脂类及类脂分子，29.17%为有机酸及其衍生物，12.50%为有机杂环化合物（图3A）。随后筛选出在神经系统和代谢性疾病中起重要作用代谢物，发现其中有9种代谢物表达上调，11种代谢物表达下调（图3B）。而将CPF组与CD组中差异代谢物进行比较，发现21种差异代谢物有显著差异，包括12种上调和9种下调的代谢物（图3C）。随后作者通过KEGG通路分析发现，在持续黑暗环境中，CD组小鼠的嘌呤代谢、甘油磷脂代谢和色氨酸代谢通路有显著变化（图2D）。而施用CPF之后，小鼠的嘌呤代谢、精氨酸生物合成和甘油磷脂代谢通路出现显著变化（图2E）。

四、粪便微生物类群与肠道差异代谢物的相关性

作者通过Spearman相关性分析确定肠道微生物群组成与施用CPF影响的肠道代谢物之间的相关性。发现大部分上调的代谢物与拟杆菌门和疣微菌门的丰度呈正相关，而与厚壁菌门的丰度呈负相关（图4A）。

作者重点关注了CPF调节的微生物类群：阿克曼菌、瘤胃梭菌和瘤胃梭菌。通过相关性分析发现CPF组小鼠肠道中丰度增加的阿克曼菌属与黄豆苷元、木犀草素、(1'R)-荆芥酸和O-去甲基血管苷元等代谢物呈正相关，而与酰基肉碱、肠内酯和溶菌素则呈负相关。CPF组小鼠肠道中梭状芽孢杆菌与肠内酯和亮氨酸呈显著正相关。瘤胃梭菌则与肠内酯和酰基肉碱呈正相关，但与溶血opc、雌马酚和木犀草素呈负相关（图4B）。结果显示，施用CPF后肠道菌群的增加和减少与代谢产物有一定的相关性，说明CPF促进肠道菌群修复肠道环境，调节了一些有益代谢产物的释放。

五、单细胞转录组测序鉴定了小鼠下丘脑中与昼夜节律相关的脑细胞群

为了比较小鼠下丘脑中的细胞类型，作者通过单细胞转录组测序确定了小鼠下丘脑中与昼夜节律相关的脑细胞群，并对其进行聚类分析。结果显示，CD组有18个细胞类型，CPF组有19个细胞类型，与CD组相比，CPF组中Cluster0、3、6、7、8细胞数增加，而Cluster1、2、4、5中细胞数则减少（图5A、图5B）。

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随后作者对脑细胞类型进行注释（图5C），发现成纤维细胞仅存在于CPF组中，并且CPF组中星形胶质细胞数比CD组更为丰富，而少突胶质细胞数较少（图5D，图5E，图5F）。

六、CPF对下丘脑生物钟基因表达的影响

随后作者选择了八个生物钟基因（Bmal1、Clock、Cry1、Cry2、Per1、Per2、Per3和Rora）来进行研究。通过tSNE图分析CPF组和CD组小鼠下丘脑昼夜节律基因的表达模式，发现生物钟基因Clock、Cry2、Per1、Per2、Per3和Rora在 CPF 组中具有较高的表达率（图6A，图6B）。其中，CD组cluster7中节律基因Per1的百分比表达率和平均表达量最高，而节律基因Per3在cluster0中也表现出较高的表达率（图6C）。

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节律基因Per3和Rora的表达量显著高于其他基因，而节律基因Clock、Cry1、Cry2、Per1、Per2、Per3和Rora的表达水平在cluster0、3、6、7、8 中表达更为显著（图6D）。

七、施用CPF可以影响髓鞘形成和神经退行性疾病相关基因

为了了解CPF如何影响脑细胞的生物学功能，作者经分析发现施用CPF后引起361个基因上调和384个基因下调。通过GO分析发现这些基因与树突棘、中枢神经系统髓鞘化等相关（图7A）。其中中枢神经系统髓鞘形成相关的的差异表达基因有1个上调的和7个下调的（图7B）。

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此外，通过KEGG分析发现差异表达基因主要分布在胰岛素分泌、帕金森病和阿尔茨海默病的通路上（图7C）。其中，胰岛素分泌通路中包含6个上调基因和4个下调基因，帕金森病通路包含2个上调基因和14个下调基因，而阿尔茨海默病通路包含7个上调基因和14个下调基因（图7D-F）。这些结果表明CPF可能对神经退行性疾病有改善的效果。

总结

作者采用多组学分析方法，研究了青钱柳黄酮（CPF）对昼夜节律紊乱小鼠肠道菌群、代谢物和下丘脑节律基因的影响。结果表明，CPF可改变由昼夜节律紊乱引起的肠道菌群和代谢产物的特定组成和功能。通过相关性分析发现，这些肠道微生物与代谢产物存在一定的相关性，提示CPF可能通过调节某些有益代谢产物的释放，从而帮助肠道菌群恢复肠道环境。通过单细胞测序发现，CPF能够调节了与昼夜节律、髓鞘形成和神经退行性疾病相关的基因表达。

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